什么時候需要緩沖溶液
在反相色譜分析中，流動相的pH值一般在2-7之間，當分析物在反相條件下可離解，或樣品的pH值在2－7之外時，就需要緩沖液，在反相條件下可離解的化合物一般有氨基和羧基，他們的pKa在1－11之間，選擇正確的緩沖液pH值可保證可離解的官能團處于一種形式，離子形式或中性化合物的形式；如果樣品的pH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害，常規硅膠基質色譜柱的pH耐受范圍2-8。
如何選擇緩沖液pH值
在選擇緩沖液pH值之前，應先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa兩個單位的值，有助于獲得良好的峰形，溶液PH值高于或低于兩個pKa兩個單位，化合物99％以一種形式存在。一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。
如何確定適當的pH適用范圍(僅適用于反向色譜法分析離子化合物方法開發中流動相pH的確定)
一.考察離子化合物的pKa值
在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻或者根據化合物的結構按照下圖中列出的主要酸堿官能團在水溶液的pKa值進行推測
注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導致pKa出現1-2個單位的差異。對于酸性化合物，當含有吸電子基團時會導致酸性增強，pKa值相應降低；對于堿性化合物，當含有吸電子基團時會導致堿性降低，pKa值相應降低。
二.根據化合物pKa值推測流動相相應使用的pH
先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：
流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響
根據這幅圖，我們可以看出，當流動相的pH約等于化合物的pKa時，可以限度的調整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內，在實驗室很難控制，重現性較差，成為分析的瓶頸。
但我們實驗時可以將pH范圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值±1.5個單位的范圍內（上圖所示的II范圍內）就可以對化合物保留行為產生比較明顯的影響，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個單位以內(當流動相pH控制范圍較窄時建議使用緩沖鹽的質量進行控制，比pH計進行控制效果更優)。
通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關系。主要依據化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。
可能有人會發現第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準確調節pH在化合物pKa±1.5范圍內進行提高選擇性。
在做實驗時發現有的物質會因稀釋液pH使用不當產生峰分叉的現象，調節稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa±2的范圍內時離子化合物并沒有出現峰分叉、峰型不好現象。
三.根據流動相pH值測定所需要的緩沖鹽
1.緩沖液選擇主要依據：
（1）緩沖溶液的pKa和緩沖容量
（2）溶解度
（3）紫外吸收
2.對以上三點進行說明
(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩沖能力很大，pKa與流動相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動相的pH與緩沖液的pKa值不能超過±1.0個單位，當緩沖溶液濃度較高時可以放寬范圍到1.5個單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見下圖：
緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導致緩沖能力不足（可通過調整進樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現拖尾或者前沿現象，說明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過大會導致與有機相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。
（2）根據緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發現，當pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。
（3）根據化合物的吸收波長：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測波長。
3. 緩沖鹽的作用：
緩沖鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時間的穩定性。
高效液相色譜法中選擇緩沖鹽的注意事項
在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對維持流動相恒定pH和提高保留時間的重現性都非常重要。
怎么選擇緩沖液：
Pka和緩沖容量
溶解度
紫外吸光度（使用UV檢測器）
揮發性（MS蒸發光散射檢測器）
離子對性質
穩定性和儀器的兼容性
根據以上的理論，流動相緩沖容量取決于緩沖鹽的pka，緩沖鹽濃度，流動相pH。
當緩沖液中溶質的的兩種形態（HA和 A-）濃度相等時，即緩沖鹽的pka與流動相pH相等時，緩沖能力很大。當流動相的pH與緩沖鹽的pka相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pka與流動相的pH相差不能超過±1.0個單位。
流動相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關系，通常濃度范圍為5~25mmol/l。
樣品溶解在流動相中可以避免在反相色譜過程中發生緩沖能力的問題，尤其是流動相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時候尤為重要。
當緩沖容量偏低時，可以從以下方面調節緩沖容量：
1、減少緩沖液pKa與流動相pH之間的差異（可調節pH或更換緩沖液）
2、礦大流動相pH和溶質pKa之間的差異（當差異足夠大時，溶質倍完全離子化或者保持非離子化形式此時緩沖液顯的不重要了）
3、增加緩沖液濃度
4、減少樣品進樣體積
5、調節樣品的pH與流動相的一致。
